Pengujian Sifat Biokimia

Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray, 2005).

Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap rekasi biokimia dikatalis oleh enzim. Enzim merupakan katalis yang lebih efisien daripada kebanyakan katalis laboratorium atau industri. Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelas katalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh gugs-gugus polar (atau non polar) yang teedapat dalam struktur enzim tersebut. Beberapa enzim bekerja bersama suatu kofaktor non protein, yang dapat berupa senyawa organik maupun anorganik (Lehninger, 1995).

Berikut beberapa uji biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri antara lain:

1. Indol

Media ini biasanya digunakan dalam identifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaks seperti Ehrlich yang megandung para-dimetil-aminobenzaldehida (Choirunissa, 2011).

2. Uji gula-gula (Glukosa, Laktosa, Sukrosa dan Manitol)

Uji ini dilakukan untuk mengindetifikasi bakteri yang mampu memfermentasikan karbohidrat. Pada uji gula-gula hanya terjadi perubahan warna pada media glukosa yang berubah menjadi warna kuning, artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi glukosa. Pada media glukosa juga terbentuk gelembung pada tabung durham yang diletakan terbalik didalam tabung media, artinya hasil fermentasi berbentuk gas (Oktarina, 2010). Reaksi fermentasi gula yaitu :

fermentasi

C₆H₁₂O₆                                          C₂H₅OH+ CO₂ + asam

Menurut Robert, dkk (1959), Escherichia coli dapat melakukan fermentasi glukosa dan laktosa, sementara itu sukrosa tidak dapat difermentasikannya. Pada Bacillus subtilis dapat melakukan fermentasi terhadap glukosa dengan hasil yang tidak terjadi perubahan.

3. Hidrolisis pati

Menurut Jutono (1980), suatu bakteri mempunyai suatu enzim yang dapat menghidrolisis polisakarida, misalnya pati menjadi senyawa gula yang lebih sederhana. Suatu bakteri yang mempunyai enzim amilase dapat menghidrolisis pati (suatu polosakarida) menjadi maltosa (disakarida). Reaksi hidrolisis pati menjadi maltosa adalah sebagai berikut :

amilase

2 ( C₆H₂O₉)n +n H2O                                         n C₁₂H₂₂O₁₁

bakteri

Menurut Sale (1961), amilase adalah enzim ekstraseluler yang disekresi oleh bakteri untuk mengubah pati yang tidak dapat terdifusi. Fraksi terdifusi dapat masuk ke dalam sel dan diproses oleh enzim intraseluler. Fraksi terdifusi di dalam sel oleh enzim maltase dihidrolisis lebih jauh menjadi D-glukosa. Hasil dari fermentasi pati merupakan hasil dari penggunaan glukosa intraseluler. Keberadaan amilase dapat diamati dengan menyaring kultur broth dan mencampunya dengan pati. Menghilangnya pati menunjukkan keberadaan amilase. Ini dapat langsung diketahui dengan menambahkan beberapa teets larutan iodin. Warna biru menunjukkan keberadaan pati, warna coklat menunjukkan hidrolisis sempurna dari pati menjadi maltase.

Menurut Robert, dkk (1959) Escherichia coli tidak dapat melakukan hidrolisa pati, sementara  Bacillus subtilis dapat melakukan proses hidrolisis pati. Proses hidrolisa ini biasanya memecah suatu gula yang kompleks menjadi suatu susunan gula yang sederhana, untuk mendeteksi peristiwa ini dilakukan dengan cara pemberian iod. Iod biasanya akan bereaksi dengan pati dan akan berwarna biru. Hal ini menunjukkan bahwa tidak terjadi hidrolisa bila pati pun dapat bereaksi dengan iodium dan menghasilkan warna biru, hal ini dapat terjadi disebabkan oleh karena pati belum terpecah menjadi senyawa sederhana sehingga komponen yang bereaksi sengan iodium adalah pati.

4. Peptonisasi

Peptonisasi adalah perubahan dari bentuk tidak larut menjadi larut pada bermacam-macam protein dan menunjukkan adanya pemecahan protein menjadi pepton yang terjadi pada keadaan aerob dan anaerob (Jutono dkk, 1980). Menurut  Robert, dkk (1959), Escherichia coli menunjukan terjadi peptonisasi dengan terbentuknya endapan bening dibagian dasarnya dan Bacillus subtilis menunjukkan terjadi peptonisasi dan fermentasi secara bersama-sama sehingga terjadi lapisan dan tidak terdapat whey.

5. Fermentasi susu

Air susu mengandung bermacam-macam zat, yaitu air, karbohidrat, (laktosa), lemak, protein (kasein), garam-garam  mineral dan vitamin-vitamin. Medium susu (tanpa lemak) digunakan untuk pengujian fermentasi, peptonisasi atau kedua-duanya yang terjadi bersama-sama. Pada peptonisasi susu kasein dihidrolisa oleh enzim renin menjadi parakasein dan pepton-pepton yang terlarut. Parakasein itu kemudian akan bereaksi dengan garam-garam kalsium membentuk endapan kalsium para kaseinat. Pada peptonisasi sempurna endapannya terkumpul dibawah dan kemudian cairan susu menjadi jernih. Pada peptonisasi reaksi medium menjadi basa sehingga warna indikator ( misalnya bromokresol purpule ) ungu terang. Pada fermentasi laktosa, berbah menjadi asam, sehingga menyebabkan kasein mengendap atau menggumpal. Adanya asam ini akan menentukan pertumbuhan bakteri lebih lanjut, sehingga peruraian protein tidak terjadi (Jutono dkk, 1980).

Kasein adalah protein yang dapat bereaksi dengan asam maupun basa (amfoter). Kasein terdapat pada susu dan membentuk fasa koloid. Beberapa bakteri mensekresikan enzim seperti renin yang dapat menghidrolisis kasein. Menjadi parakasein terlarut dan bahan seperti pepton. Parakasein bereaksi dengan garam kalsium membentuk kalsium parakaseinat bakteri yang cepat memfermentasikan laktosa akan menghasilkan asam yang cukup banyak dan dapat menghambat penjenuhan kasein. Asam dapat mencegah pertumbuhan bakteri lebih jauh, bakteri yang tidak memfermentasi laktosa memproduksi renin kasar. Ini memungkinkan terjadinya peptonisasi kasein dan pembentukkan berbagai fraksi terlarut, sehingga usus menjadi basa. Bakteri yang memfermentasi laktosa dengan lambat tidak dapat mencegah peptonisasi (Sale, 1961).

6. Uji reduksi nitrat

Keberadaan nitrit dalam media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan α-naftilamin yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan warna media menjadi merah atau merah muda. Pada tabung yang tidak menunjukkan perubahan warna, ditambahkan bubuk Zn untuk melihat reduksi nitrat menjadi nitrit. Bila didapatkan nitrat dalam medium, maka kaldu berubah warna menjadi merah muda atau merah karena Zn mereduksi nitrat menjadi nitrit dan nitrit ini bereaksi dengan reagen uji dan terbentuk warna merah (Lay, 2004).

Reduksi nitrat terjadi pada kebanyakan bakteri anaerob fakultatif dengan menggunakan nitrit. Reaksinya:

NO₃^– + 2e^– +    2H²⁺   Nitratase        NO₂^– + H₂O

O₂ dapat menghambat reduksi nitrat sehingga dalam reaksi, O₂ dihabiskan kemudian menggunakan nitrat pada bakteri anaerob ( Suriawiria, 1985 ).

Eschericia coli memiliki sifat biokimia yaitu jika diinokulasi pada medium glukosa, laktosa, dan sukrosa dapat melakukan fermentasi dengan membeentuk asam dan gas. Eschericia coli juga dapat menghidrolisis amilum, pati, membentuk indol pada medium triptofan, dapat mereduksi nitrat, dan memfermentasi susu dengan menghasilkan asam. Bacillus subtillis jika diinokulasi dalam medium glukosa yaitu jika diinokulasi dalam medium glukosa dan sukrosa dapat membentuk gas, pada medium laktosa tidak dapat menghasilkan asam maupun gas. Bacillus subtillis tidak dapat membentuk indol pada medium triptofan, mereduksi nitrat, dan pada medium susu dapat melakukan fermentasi dan peptonasi (Breeds, 1957).

Sifat-sifat biokimia dari bakteri meliputi hidrolisa lemak, penguraian protein, perubahan karbohidrat, serta reduksi bermacam-macam unsur. Gula dapat difermentasi menjadi alkohol, asam atau gas. Tergantung pada gula dan jenis bakterinya. Escherichia coli dapat memfermentasikan  sukrosa, glukosa, dan laktosa. Pada sukrosa cair, padat dan glukosa cair, padat serta laktosa padat yang pertama terbentuk adalah asam dan gas (Pelczar dan Chan , 1988).

Tabel 1. Fermentasi Karbohidrat

Bakteri	Medium	Warna awal	Warna akhir	Asam	Gas	Reaksi
E. coli	Laktosa padat	Hijau tua	Kuning	Ada	Ada	+
	Laktosa cair	Merah	Kuning	Ada	Ada	+
	Glukosa padat	Hijau tua	Kuning	Ada	Ada	+
	Glukosa cair	Merah	–	–	–	–
	Sukrosa padat	Hijau tua	Hijau tua	Ada	Ada	+
B.subtilis	Laktosa padat	Hijau tua	Hijau muda	Ada	–	+
	Laktosa cair	Merah	–	–	–	–
	Glukosa padat	Hijau tua	Hijau muda	Ada	–	+
	Glukosa cair	Merah	Kuning	Ada	Ada	+
	Sukrosa padat	Hijau tua	kuning	ada	–	+

Tabel 2. Fermentasi susu dan peptonisasi

Bakteri	Medium	Fermentasi susu	Peptonisasi	Reaksi
E. coli	BCPM	Ada lapisan warna kuning	Ada endapan warna hijau	+
B. subtilis	BCPM	Tidak ada fermentasi (warna merah)	Ada endapan warna hijau	+

Tabel 3. Hidrolisis pati

Bakteri	Warna awal	Warna akhir	Reaksi
E. coli	Putih susu	Coklat	+
B. subtilis	Putih susu	Coklat	+

Tabel 4. Reduksi Nitrat

Bakteri	Warna awal	Warna akhir	Reaksi
E. coli	Kuning bening	Kuning orange	–
B. subtilis	Kuning bening	Kuning orange	–

Tabel 5. Pembentukan indol

Bakteri	Warna awal	Warna akhir	Reaksi
E. coli	Kuning bening	Bening kekuningan (terbentuk cincin)	+
B. subtilis	Kuning bening	Bening kekuningan	+

Uji fermentasi dilakukan dengan medium glukosa padat dan cair, sukrosa padat dan cair, laktosa padat dan cair. Fermentasi adalah penggunaan piruvat atau derivatnya sebagai aseptor electron untuk mengoksidasi NADH menjadi NAD. Sedangkan fermentasi karbohidrat adalah perombakan monosakarida menjadi alkohol, gas karbondioksida, asam organik dan energi dengan bantuan mikrobia. Adanya asam organik akan mengubah pH medium sehingga indikator akan memberikan respon dan terjadi perubahan warna pada medium. Pada indicator fenol merah yang digunakan jika dalam kondisi asam akan menjadi berwarna kuning. Semua jenis medium cair diberi tabung durham untuk menangkap gas yang terbentuk akibat hasil metabolisme sel bakteri.

Pada medium  laktosa padat Escherichia coli terbentuk gas pada tabung durham dan warna medium dari hijau tua berubah menjadi berwarna kuning, sedangkan pada Bacillus subtilis tidak terbentuk adanya gas dan warna akhirnya menjadi hijau muda dan hasil keduanya adalah positif. Hal ini menunjukkan bahwa kedua bakteri ini mempunyai enzim laktose yang mampu menghidrolisis laktosa cair menjadi monosakarida yaitu glukosa dan galaktosa. Pada medium laktosa cair, warna akhir Escherichia coli adalah kuning dan terbentuk gas sehingga menunjukkan hasil positif, sedangkan pada Bacillus subtilis tidak terjadi perubahan warna sehingga hasilnya negatif. Hal ini menunjukkan bahwa Bacillus subtilis tidak mempunyai enzim laktose yang mampu menghidrolisis laktosa cair menjadi monosakarida yaitu glukosa dan galaktosa.

Pada medium glukosa padat, warna akhir Escherichia coli adalah kuning, sedangkan pada Bacillus subtilis warna akhirnya menjadi hijau muda dan hasil keduanya adalah positif. Pada medium glukosa cair, tidak terjadi perubahan warna pada Escherichia coli dan hasilnya adalah negatif, sedangkan pada Bacillus subtilis warna akhirnya menjadi hijau muda dan hasilnya adalah positif. Hal ini mungkin dikarenakan adanya kontaminasi dari bakteri lain yang mampu melakukan fermentasi pada medium glukosa.

Pada medium sukrosa padat, Escherichia coli tidak terjadi perubahan warna tetapi hasilnya positif karena terbentuk gas dari tabung durham, sedangkan pada Bacillus subtilis warna akhir medium menjadi kuning dan hasilnyapun positif. Dari hasil tersebut dapat diketahui juga kedua bakteri tersebut mempunyai enzim sukrose yang mampu menghidrolisis sukrosa menjadi monosakarida yaitu glukosa dan fruktosa.

Adanya perubahan warna pada medium yang berisi biakan bakteri sampel yang membuktikan bahwa bakteri tersebut mempunyai enzim untuk mengubah struktur gula menjadi produk fermentasi. Perubahan warna ini juga menandakan bahwa medium terbentuk asam dan asam ini akan menyebabkan pH medium turun sehingga indikator phenol red menunjukkan perubahan warna dari warna semula  merah ataupun dari warna hijau tua.

Pengujian biokimia selanjutnya adalah mengenai kemampuan B.subtilis dan E.coli dalam melakukan fermentasi atau peptonisasi terhadap susu dengan menggunakan medium BCPM (Brom Cresol Purple Milk). Uji fermentasi susu bertujuan untuk mengetahiu kemampuan bakteri dalam memfermentasi susu menjadi asam yang dapat menyebabkan kasein mengendap atau menggumpal. Uji peptonisasi bertujuan untuk mengetahui adanya pemecahan protein dari bentuk tidak larut menjadi larut. Peptonisasi terjadi dalam keadaan aerob dan anerob:

Kasein     Renin       parakasein + pepton-pepton terlarut

Garam Ca

Calsium Parakaseinat

Fermentasi susu merupakan peristiwa perubahan bentuk susu menjadi asam sehingga menyebabkan kasein menggumpal atau mengendap. Bila peptonisasi sempurna, endapan terkumpul di bawah dan cairan susu menjadi jernih. Pada fermentasi susu reaksi yang terjadi adalah:

fermentasi

Laktosa                            susu

Hubungan antara peptonisasi dan fermentasi adalah:

Kasein + Asam                   Asam menghentikan pertumbuhan mikroorganisme, sehingga tidak terjadi peruraian protein. Bila fermentasi lambat → asam yang terbentu sedikit → kasein tidak menggunpal. Penghambatan kerja mikroorganisme tidak terjadi → perubahan kasein berlangsung terus menerus, sehingga peptonisasi dan fermentasi terjadi secara bersama-sama.

Pada medium BCPM yang diinokulasikan E.coli menunjukan hasil positif yaitu terbentuk endapan berwarna hijau dan terjadi perubahan warna yang pada awalnya berwarna keabu-abuan menjadi berwarna berwarna kuning. Warna kuning yang terjadi disebabkan oleh adanya respon indicator terhadap perubahan pH yang menjadi asam. Asam yang terdapat didalam medium adalah asam organik hasil fermentasi oleh E.coli. Fermentasi yang terjadi didalam medium tersebut  adalah fermentasi laktosa. E.coli merupakan bakteri yang memiliki enzim beta-galaktosidase yang dapat memecah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, sehingga E.coli mampu memfermentasikan laktosa.  Pada B. subtilis, tidak terjadi fermentasi tetapi peptonisasi dapat terjadi karena B.subtilis tidak memiliki enzim beta-galaktosidase sehingga tidak dapat memecah laktosa sehingga asam organic tidak terbentuk dan kasein tidak menggumpal. Karena kasein tidak menggumpal maka kasein akan dihidrolisis oleh enzim rennin dan enzim protease yang terdapat dalam B.subtilis menjadi para kasein dan pepton-pepton terlarut.

Uji biokimia selanjutnya adalah uji kemampuan bakteri dalam  menghidrolisis pati. Kemampuan menghidrolisa pati diketahui dengan cara memberikan larutan iodium pada medium yang sudah diinkubasi. Perubahan warna diamati, pati yang terhidrolisis bakteri akan membentuk warna jernih ketika diberi iodium. Pati yang tidak terhidrolisis akan tetap berwarna biru, menandakan bahwa amilum masih dikandung oleh medium dan tidak dihidrolisis bakteri. Larutan iod dalam uji ini menjadi indikator adanya hidrolisa pati. Hasil yang didapatkan setelah penetesan iod pada E. coli dan B. subtilis adalah terjadi perubahan warna dari putih susu menjadi berwarna coklat yang menunjukkan reaksi yang terjadi adalah positif. Karena

Uji selanjutnya adalah uji kemampuan E.coli dan B.subtilis dalam mereduksi nitrat menggunakan medium nitrat. Uji reduksi nitrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan suatu bakteri di dalam mereduksi nitrat menjadi nitrit. Pembentukkan nitrit ditandai dengan terbentuknya warna merah setelah ditambahkan asam sulfanilat dan α naphtylamine dan merupakan hasil reduksi nitrat. Reaksinya adalah :

nitratase

NO₃^– + 2e^– + 2H⁺                          NO₂^– + H₂O

E.coli dan B.subtilis menunjukan hasil negatif karena warna akhir yang terbentuk bukan warna merah melainkan kuning orange atau kuning bening. Hal ini menunjukkan bahwa kedua bakteri tersebut tidak mampu mereduksi nitrat menjadi nitrit.

Uji biokimia yang terakhir adalah uji pembentukan indol dengan menggunakan medium hidrolisat kasein yang didalamnya terkandung asam amino Triptofan. Triptofan yang memiliki cincin indol akan didegradasi oleh bakteri dengan bantuan eter. Setelah itu, indol yang dilepaskan akan berikatan dengan reagen Ehrlich membentuk cincin warna merah. Terbentuknya indol disebabkan oleh tryptophan teroksidasi oleh proses enzimatik oleh enzim tryptophanase.

Hasil yang didapat menunjukkan bahwa adanya cincin pink pada medium hidrolisa yang ditambah dengan kafein baik pada Escherichia coli maupun Bacillus subtilis sehingga hasilnya positif dalam uji pembenukan indol. Sesuai dengan buku Bergey`s Manual Determination of Bacteriology yang menyebutkan bahwa kedua bakteri ini akan membentuk cincin merah yang terbentuk karena indol teroksidasi oleh penambahan reagen erlich yang mengandung eter.

DAFTAR PUSTAKA

Breed, R.S, E.G.D., Murray, U.R., Smith, 1957, Bergey`s Manual Determination of Bacteriology, seventh edition, The Wiliams and Wilkins Company, USA.
Choirunnisa, A. A. 2011. Uji Biokimia. http://choalialmu89.blogspot.com/ 9 April 2011.
Jutono, J. Soedarsono, S. Hartadi, S. Kabirun, S. Suhadi, D. dan Soesanto. 1980.  Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum. Departemen Mikrobiologi Fakultas   Pertanian UGM. Yogyakarta.
Lay, W. B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Perkasa. Jakarta.
Lehninger. 1995. Dasar – dasar Biokimia, Jilid I. Erlangga. Jakarta.
Murray. 1995. Biokimia Harper. EGC. Jakarta.
Oktarina, T. 2010. Pengujian Metabolisme Mikroba. http://www.try4know.co.cc/ 8 April 2011.
Pelczar. M.J dan Chan, E.C.S. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.
Robert, S.B., E.G.D. Murray, L.R. dan Smith. Bergey’s Manual of Determinative  Bacteriology. Waverly Press Inc. USA.
Sale, A.J., 1961, Laboratory Manual on Fundamental Principle Of Bakteriology, Mac Grew Hill. Inc, Toronto
Suriawiria, U. 1985. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Angkasa. Bandung.